长久以来，细菌被认为会妨害伤口愈合。随着抗生素的出现，人们相信细菌的危害能够被控制住了。然而，有两点可以说明为什么细菌感染仍然会危害人类：抗药性（Resistance）和耐受性（Tolerance）［1］。细菌的抗药性通常被定义为一种可遗传获得的能力，这种能力使微生物可以在高浓度的抗生素中生长，且不论治疗时间的长短。抗生素耐药性常因为基因突变或质粒转移而产生，其分子机制一般会包含：细菌靶蛋白的突变，以阻止或减少抗生素与细菌蛋白的相互作用；获得一种酶活性，直接使抗生素失效；激活外排泵，将抗生素泵出。这些基因被称为“耐药基因组”（Resistome）［2］。相反，细菌的耐受性是指微生物短时间暴露于高浓度抗生素而能存活的能力，通过遗传或其它途径获得，细菌通常是通过减慢必要的生理过程如代谢、蛋白或DNA合成来实现。获得短暂的抗生素耐受性的最常见机制之一是细菌由对抗生素敏感的快速增殖的游离状态转变为含有代谢停滞细胞的细菌生物膜群落，这种状态甚至可以应对长时间的抗生素治疗。很重要的一点是，当把生物膜中的休眠细菌细胞分离出来再培养，重新暴露于抗生素时，几乎所有的细菌都会被杀灭，且最低抑制浓度（MIC）与游离细菌无异。
在慢性伤口中，生物膜的形成被认为是产生抗生素耐药的主要原因。对生物膜微生物学和治疗有效性的研究在不断进展。本文将会介绍近期关于生物膜识别、清除和杀灭的进展。
1. 快速探测伤口床生物膜
对于临床医生来说，最大的挑战是准确评估慢性伤口是否存在细菌生物膜，及其在什么位置。一项对81名医生的调查显示生物膜被认为存在于大部分慢性伤口，但大部分医生并不太了解生物膜对伤口愈合和感染的影响［3］。与生物膜存在相关的四个常见的表现包括难愈合的伤口、伤口表面粘(液)膜、感染／炎症迹象和渗液增加、抗菌治疗无效。根据可视指针专家组制定了识别生物膜的临床算法，指针包括伤口床表面物质去除的难易度、表面物质再形成的快慢、局部或全身抗生素治疗或抗菌敷料治疗效果不佳、使用多重方法（清创、清洗、局部抗菌剂和敷料）愈合改善［4］。
近期报道了一项简单、快速、经济的技术，用以检视和发现伤口床表面的生物膜［5］。这项“伤口生物膜标记”（Biofilm wound map）技术用高吸附性膜覆压伤口床，非特异性吸附生物分子，例如游离细菌DNA、多聚糖、蛋白质和脂质，这些物质是细菌生物膜胞外多聚基质（Exopolymeric matrix）的主要成份［6］。随后将吸附膜在高浓度阳离子染料（如钌红）中短时间浸泡，然后用生理盐水或稀释醋酸冲洗几分钟，吸附膜染料着色部分即对应伤口床含有生物膜的部分。如图1所示，有些慢性压疮可以发现生物膜胞外多聚基质，而另一些则没有。使用这一技术对16个患者的23个压疮清创后的伤口床进行70次检查，结果61%的伤口床发现了生物膜。更重要的是，阳性染色的伤口床（即含有生物膜）在接下来的治疗一周后腐肉面积减少比例最低（约3%），而阴性染色的伤口床腐肉面积平均减少45%（p=0.03）。因此，这一技术可以用于清创前／后探查伤口床生物膜，清创（生物膜）彻底预示着更显著的腐肉减少和炎症减轻，即更好的愈合。
图1: 伤口生物膜地图标记技术。图A为78岁男性骶尾部II期压疮，图B为阳性染色，图C为治疗1周后腐肉形成情况；图D为57岁女性大腿部II期压疮，图E为阴性染色，图F为治疗1周后腐肉显著减少的情况。
2. 生物膜清创
在慢性伤口治疗初期，基于生物膜的伤口治疗（Biofilm-based wound care）的两个重要核心原则之一是有效清除生物膜。随着医疗级丝光绿蝇（Lucilia sericata）蛆虫的商业化，蛆虫清创治疗（LDT）正被越来越多的用于临床。一项随机双盲对照研究（RCT）比较了LDT（n=51）和传统方法（外科清创3次／周）(n=54)在慢性腐肉伤口中的应用，治疗期为2周［8］。治疗第8天时，两组之间的腐肉比例有显著差异（p=0.04），LDT组为54%，而传统组为66%。然而，第15天时两组间没有差异。另外两项RCTs发现LDT与水胶体敷料－自溶性清创相比，可以显著减少清创时间［9,10］。
基于上述鼓舞人心的结果，我们在思考：LDT对于清除伤口生物膜有何效果？我们使用了猪皮肤培植体生物膜模型来模拟慢性皮肤伤口生物膜，尤其是生物膜生长环境极为相似，即真皮细胞外基质［11］。如图2所示，对于成熟绿脓杆菌（PA01）或金葡菌（SA35556）生物膜，LDT治疗2天后，游离和生物膜细菌均降至无法探测到的水平［12］。以这些实验室数据作为基础，一项评价LDT对慢性伤口生物膜作用的临床研究正在进行。
图2: LDT治疗成熟绿脓杆菌或金葡菌生物膜2天后，游离和生物膜细菌均降至不可探测水平。
负压伤口治疗（NPWT）结合周期性抗菌容液灌注亦被用于治疗炎性慢性伤口，使用抗菌伤口冲洗容液可以显著减少猪皮肤生物膜模型（绿脓杆菌）的生物膜集落形成单位（CFU）。另有报道接触或非接触超声清创技术，均在实验室模型中显著降低生物膜CFU。此外，使用抗菌伤口冲洗液替代生理盐水传导超声能量，可以进一步降低生物膜细菌水平。
3. 破坏生物膜
另一个关于清除或减少生物膜的研究领域是关于使用物理化学方法破坏或杀死生物膜，例如使用基于博洛沙姆的表面活性剂，商品名普兰尼克。这是一种非常独特的合成聚合物表面活性剂，与其它合成聚合物相反，其在加热时成胶，而冷却时变为液体。近期研究人员评估了一种高浓度非离子型表面活性剂PluroGel（普兰尼克凝胶）对猪皮模型成熟绿脓杆菌生物膜的抑制作用［13］。如图3所示，细菌总体（包括游离和生物膜细菌）CFU为5X10^8，其中5X10^4为生物膜细菌。使用纱布敷料擦猪皮时，总体CFU和生物膜CFU均减少了2-logs（99%）。然而即便每日都擦，细菌水平仍可以快速恢复，第3天时，生物膜细菌完全恢复。相反，使用纱布敷料擦试结合PluroGel可以不断减少游离和生物膜细菌水平，治疗3天后未发现存活细菌。上述实验室数据与一项涉及1036名患者的临床研究结果基本一致，这项研究使用含有磺胺嘧啶银的普兰尼克凝胶对慢性伤口进行治疗，显示出非常好的愈合效果［14］。
图3: 普兰尼克凝胶表面活性剂的效果。
4. 卡迪姆碘敷料对慢性伤口生物膜的作用
基于生物膜的伤口治疗的另一个主要原则是结合清创与抗菌敷料，不仅可以阻止细菌生长，而且可以形成阻止细菌进入伤口床的屏障。我们之前的研究显示一种卡迪姆碘凝胶（CIG）（Iodosorb）可以持续数天释放碘离子，是唯一一种可以完全清除猪皮绿脓杆菌或金葡菌的杀菌敷料［15］。虽然实验室结果令人兴奋，但CIG减少游离和生物膜细菌的临床效果必须通过随机对照临床研究来评估。近期一项关于CIG治疗慢性溃疡的研究，入组19例慢性糖尿病足溃疡（DFU级别1或2，直径≥3cm），怀疑存在生物膜，随机分为CIG或水凝胶组，均使用无粘边泡沫敷料作为二层敷料，胶带固定。水凝胶组每日换药，CIG组每周至少2次换药。初次治疗前和2周和4周时均行清创和采集组织标本用于细菌分析。研究的主要评价结果是生物膜保护细菌在2周和4周时与基线水平相比的变化。如图4所示，2周时，CIG组生物膜计数（CFU／g）减少1log，而水凝胶组增加0.3log，差异具有显著性。4周时，CIG组维持1log的下降水平，而水凝胶组减少0.8log（p=0.34）。
图4:卡迪姆碘凝胶与水凝胶敷料2周治疗效果的比较
结论
细菌生物膜被认为是促进伤口慢性炎症的主要原因，常见于多种疾病，包括慢性中耳炎、囊性纤维化、骨髓炎、以及导管相关的慢性感染。大量的证据也显示细菌生物膜在促进慢性炎症的同时会导致蛋白酶和ROS的增加，导致愈合所必需的蛋白质的破坏而无法愈合。新的生物膜诊断工具、对有效生物膜清创的更深入理解、使用敷料防止生物膜再形成等促成了基于生物膜的伤口治疗的概念的形成，而这一概念建立在伤口床准备的核心原则之上。最终，医务人员对于生物膜独特特性和如何选择与使用不同治疗方法的更深入理解会帮助我们更有效地改善慢性伤口的愈合。
本文作者为Schultz GS, Gibson DJ, Lantis J & Nakagami G，文章发表于IWII杂志Volume 24, Number 4, December 2014。
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